ウエストナイルウイルス感染症 検査法


現在、TaqMan PCRに関して、感度特異性を検討中です。
マニュアル第3版掲載しました。


ウエストナイルウイルス病原体検査マニュアルVer.4.0(PDF版)
Ver.2では
PCRの反応液作製部分で現状に即していない部分がありましたので、変更してあります。
TaqMan PCR法の検査法掲載しています。TaqMan PCR法の反応組成に説明が加えてあります。
また、IgM捕捉ELISA法による日本脳炎とウエストナイル熱/脳炎の鑑別のために、日本脳炎ウイルス抗原とウエストナイルウイルス抗原の定量法に関するプロトコールを新たに追加しました。


Ver.3.0では、
TaqMan PCR法のLight Cyclerを用いた場合の条件を掲載しました。(2005/5/18更新しました)

P3設備のある検査機関にはウエストナイルウイルス[g2266株、FCG株(M12294)]は分与は可能です。
分与願の書式は、下記の如くです。
FCG株(M12294)のシークエンスへM12294
病原体分与に際しては、こちらから郵送したりしません。持ち帰りが原則ですが、現在公共交通機関に病原体を持ち込むことは、禁止されています。輸送手段等を計画・確立されてからご相談ください。

NY株を用いたRT-PCR感度に関して

g2266, FCG株に関しては、これよりは10倍以上感度がおちます。


リアルタイムPCR(TaqMan PCR)について
Primer:

WN3'NC-forward (10668-10684) CAG ACC ACG CTA CGG CG
WN3'NC-reverse (10770-10756) CTA GGG CCG CGT GGG
WN3'NC-probe (10691-10714) TCT GCG GAG AGT GCA GTC TGC GAT

Primer:
WNENV-forword (1160-1180) TCA GCG ATC TCT CCA CCA AAG
WNENV-reverse (1209-1229) GGG TCA GCA CGT TTG TCA TTG
WNENV-probe (1186-1207) TGC CCG ACC ATG GGA GAA GCT C


上記二種類のプライマー・プローブセットを用いて、リアルタイムPCRを実施した。
  (参考文献:Lanciotti RS. et al Rapid detection of WNV from human clinical specimens, field-collected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan reverse transcriptaze-PCR assay. J. Clin. Micobiol. 38:4066-4071. 2000)

使用機種(ABI Prism 7000, Bio-Rad iCycler)

増幅条件
48℃ 30min
95℃ 10min.
95℃ 15sec. & 60℃ 1min. (45cycle)

               
               感度は、上記アッセイでは1pfu/tubeまでであったが、
               0.1pfu/tubeまで検出可能であることを確認した


日本脳炎ウイルス(JaGAr, Beijing 1, Muar, Tenga)、Apoiウイルスで陰性であった。
ウエストナイルウイルス(g2266、FCG株)でも陰性であった。標準株であるEg101は、
検出可能であるが、ENVのプライマーでは、感度が低い。


 結論として、現在米国で流行している株に対しては、感度が高く特異的である。米国からのウイルス侵入に備えるためには、極めて有用であるが、他の地域のウエストナイルウイルスには検出不可能な場合がある。

注意事項:Invitrogen社が、米国で販売しているWNV用Lux Primerキットは、日本脳炎ウイルスの種々の株を用いて検討した結果、陽性を示すことを確認しました。輸入することは可能ですが、我が国で使用すると混乱をきたしますので、使用しないでください(2004/8/10)現在。

2005/5/17更新